Emodin a Aloe-emodin potlačují proliferaci buněk rakoviny prsu

název (cs) Emodin a Aloe-emodin potlačují proliferaci buněk rakoviny prsu inhibicí ERα.
název Emodin and Aloe-Emodin Suppress Breast Cancer Cell Proliferation through ERα Inhibition.
publikace Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Volume 2013, Article ID 376123, 12 pages ISSN PMC3707228
autoři Hsuan Huang P1; Yang Huang CH2,3; Chih Chen M1,4; Tsung Lee Y1,5; Herng Yue CH1,6; Yi Wang H1,7; Lin H1,4,8,9; Akademický editor: Gautam Sethi vydáno 2013-06-06
pracoviště
(Taiwan)
Department of Life Sciences, National Chung Hsing University, Taichung 40227, Taiwan.
Department of Health and Nutrition Biotechnology, Asia University, Taichung 41354, Taiwan.
Graduate Institute of Basic Medical Science, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan.
Department of Urology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75390, USA.
Department of Surgery, Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital, Changhua 50544, Taiwan.
Department of Surgery, Tungs’ Taichung MetroHarbor Hospital, Taichung 43304, Taiwan.
Department of Nuclear Medicine, Taichung Veterans General Hospital, Taichung 40705, Taiwan.
Department of Agricultural Biotechnology Center, National Chung Hsing University, Taichung 40227, Taiwan.
Graduate Institute of Rehabilitation Science, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan.
e-mail hlin@dragon.nchu.edu.tw
odkaz http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3707228
http://www.hindawi.com/journals/ecam/2013/376123
překlad Jan Mizera datum 2013-09-13

copyright

Copyright © 2013 Pao-Hsuan Huang et al. Toto je volně dostupný článek distribuovaný pod licencí Creative Commons Attribution License, která povoluje volné užívání, distribuci a reprodukci v jakémkoliv médiu, za předpokladu že je původní práce řádně citována.


Abstrakt

Antrachinony emodin a aloe-emodin se v hojné míře nachází také v rebarboře. Existuje několik důkazů o tom, že emodin a aloeemodin mají estrogenní aktivity, jako fytoestrogeny. Nicméně jejich vliv na aktivaci estrogenových α receptorů, a růst buněk rakoviny prsu, je nadále kontroverzní.

Cílem této studie je prozkoumat účinky a molekulární mechanismy emodinu a aloe-emodinu na proliferaci buněk rakoviny prsu. Naše výsledky značí, že obě látky (emodin i aloe-emodin) jsou schopné inhibovat proliferaci buněk rakoviny prsu, snížením hladiny ERα proteinů, čímž je potlačena transkripční aktivace ERα. Léčba aloeemodinem navíc vedla k disociaci heat shock proteinu 90 (HSP90) a ERα a ke zvýšení ubikvitinace ERα.

Přestože měl emodin podobný účinek jako aloe-emodin, nebyl schopný podpořit disociaci HSP90/ERα, ani ubikvitinaci ERα. Výsledky frakcionace proteinů naznačují, že aloeemodin vyvolával cytosolickou degradaci ERα. Přestože by emodin také mohl vyvolávat cytosolickou degradaci ERα, měl při zablokované degradaci proteinů vliv především na distribuci ERα v jádře, podobně jako estrogen.

Na základě našich dat jsme došli k závěru, že emodin a aloe-emodin specificky potlačují proliferaci buněk rakoviny prsu tím, že rozdílnými mechanismy narušují stabilitu ERα proteinu. Tyto poznatky naznačují možné budoucí nasazení antrachinonů v prevenci a léčbě rakoviny prsu.


1. Úvod

U mnohých fytochemikálií odvozených z rostlin, včetně antrachinonů, byl zjištěn potenciál v boji proti rakovině. Deriváty antrachinonu, emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylantrachinon) a aloe-emodin (1,8 dihydroxy-3-hydroxyl-methylantrachinon), jsou hlavními bioaktivními složkami rebarbory (Rheum palmatum), jež byla využívána v tradiční Čínské medicíně [1]. Aloeemodin je rovněž bohatě zastoupen v listech známé rostliny Aloe vera [2].

Emodin byl zevrubně zkoumán pro své antibakteriální [3], protizánětlivé [4], a anti-proliferační účinky na několik typů rakovinných buněk [1]. Pozoruhodnou vlastností emodinu je, že může snižovat expresi androgenních receptorů (AR) a tím vést k inhibici růstu buněk rakoviny prostaty [5], což značí, že by deriváty antrachinonu mohly modulovat aktivitu steroidních receptorů. Na několika řádcích se též zmiňuje, že emodin a aloe-emodin mají estrogenní aktivitu a modulují, jakožto fytoestrogenní látky [6,7], proliferaci buněk rakoviny prsu. Nicméně pochopení farmakologických účinků a molekulárních mechanismů, kterými emodin a aloe-emodin modulují estrogenové α receptory (ERα) a růst buněk rakoviny prsu, nám stále uniká.

Rakovina prsu je u žen běžnou malignitou s vysokou úmrtností. Aktivace ERα hraje při vzniku, rozvoji a postupu rakoviny prsu důležitou roli, proto je dnes nejběžnějším terapeutickým postupem pro potlačení postupu rakoviny prsu estrogenová substituční terapie [8]. Syntetické látky podobné estrogenu napodobují strukturu estrogenu a tím pádem soutěží s endogenním estrogenem o vazebná místa s ERα, čímž inhibují na ERα závislý růst buněk rakoviny prsu [9,10]. Nicméně syntetické estrogeny mají vedlejší účinky, které zvyšují riziko vzniku rakoviny vlivem neselektivního působení estrogenu [11]. Účinnost přírodních fytoestrogenů je sice z hlediska estrogenního působení obecně nižší, než u syntetických přípravků, nicméně přirodní fytoestrogeny jsou relativně bezpečnější a mají méně vedlejších účinků [12]. Proto se obrací pozornost ke studiím zkoumajícím účinky a molekulární mechanismy působení přirodních rostlinných léčiv, jež obsahují fytoestrogeny, jakožto možných prostředků při léčbě rakoviny prsu.

Zjistili jsme, že inhibice proliferace emodinem a aloeemodinem u buněčných linií rakoviny prsu byla ERα-dependentní. Důležité bylo zjištění, že léčba aloe-emodinem podporuje degradaci ERα proteinu potlačením asociace ERα a heat shock proteinu 90 (HSP90). Navíc je disociovaný ERα ubikvitinován a tím označen pro proteazom-dependentní degradaci v cytosolu. Poznatky o aloeemodinu a emodinu se navzájem liší. Na základě výše zmíněných pozorování by tyto dva antrachinony být potenciálně využity, jako specifické fytoestrogeny, k léčbě rakoviny prsu.


2. Materiál a metody

2.1 Buněčné linie a kultivace buněk

Buněčné linie lidské rakoviny prsu MCF-7 a MDA-MB-453 byly získány od Bioresource Collection and Research Center (BCRC; Sbírka Biozdrojů a Výzkumné Centrum), Food Industry Research and Development Institute (Instritut pro Výzkum a Vývoj v oblasti Potravinářského Průmyslu), Taiwan. Buňky MCF-7 byly pomnoženy v minimálním základním médiu s obsahem 10% fetálního bovinního séra (Gibco), 1,5 g/L NaHCO3, 0,1 mM neesenciálních aminokyselin (Gibco), 1mM pyruvátu sodného (Gibco) a 1% penicilin-streptomycinu (Sigma, St. Louis, MO, USA). Buňky MDA-MB-453 byly udržovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (Gibco) s přídavkem 10% fetálního bovinního séra, 1,5 g/L NaHCO3, a 1% penicilin-streptomycinu. Všechny buňky byly inkubovány při teplotě 37 °C ve zvlhčované atmosféře s 5% CO2.

2.2 Stanovení životaschopnosti buněk

Po upevnění byly buňky inkubovány 24 hodin. Počty buněk byly přímým sčítáním, vyjma buněk, jež se pozitivně barvily 0,2% trypanovou modří (Sigma, St. Louis, MO, USA) [13]. Buňky byly vystaveny různým koncentracém aloe-emodinu, nebo emodinu (ChromaDex, Irvine, CA, USA) po indikovaný počet dní, a poté byla provedena kvantifikace buněčné proliferace s použitím 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromidu (MMT, Sigma, St. Louis, MO, USA). Komerčně dostupný roztok MMT (5 mg/mL) byl kompletním kultivačním médiem na koncentraci 0,5 mG/mL, a 0,1 mL zředěného roztoku bylo přidáno do každé komůrky. Žlutý MMT byl živými buňkami přeměněn na modrý formazan reakcí, jež je závislá na aktivitě mitochondriálních enzymů. Po rozpuštění modrého formazanu použitím DMSO, byla změřena absorbance přeměněného MMT při vlnové délce 570 nm [14].

2.3 Frakcionace buněk a Western Blott analýza

Buňky byly sbírány pomocí gumové stěrky a homogenizovány s Na3VO4 naředěném v PBS (1:100). Po centrifugaci byly buňky resuspendovány s již výše popsaným lytickým pufrem [15-19], a byl přidán koktejl inhibitorů proteáz (Roche Applied Science, Manheim, Germany), načež následovala inkubace na ledu po dobu 45 minut. Buněčný lyzát byl zcentrifugován a supernatant, obsahující celkové proteiny, byl sesbírán. Proteinový extrakt byl smíchán s vzorkovacím pufrem a vařen po dobu 10 minut. Poté byl proveden western blotting tak, jak již bylo popsáno výše [19,20]. Ve zkratce, byla provedena elektroforéza na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a proteiny byly přeneseny z SDS-PAGE gelu na polyvinyldifluoridovou (PVDF) membránu. Přes noc byly s membránou inkubovány primární protilátky, a byly aplikovány sekundární protilátky (Jackson Immunoresearch Laboratory, West Grove, PA, USA) konjugované s křenovou peroxidázou (HRP-). Byla provedena reakce s ECL (western lighting chemiluminescence reagent plus, PerkinElmer Life Sciences, Shelton, CT, USA) a pro vizualizaci proteinového barvení byly membrány exponovány na rentgenové filmy (Fujifilm, Tokyo, Japan). Během této studie byly použity protilátky cílené proti těmto proteinům: poly(ADP-ribosa) polymeráza (PARP, 06-557, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA); α-tubulin (05-829, Upstate Biotechnology); ERα (sc-543 a sc-8005, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); Cyklin D1 (sc-20044, Santa Cruz Biotechnology); HSP 90 α/β (sc-59577, Santa Cruz Biotechnology), ubikvitin (sc-8017, Santa Cruz Biotechnology); β-aktin (MAB1501, Millipore, Temecula, CA, USA). Ke kvantifikaci byl použit software MCID Image Analysis Evaluation.

2.4 Imunoprecipitace

Buněčný lyzát byl extrahován v lytickém pufru a imunoprecipitace proběhla již výše popsaným postupem [19]. Ve zkratce, precipitovaný komplex značka/protilátka byl připraven mícháním značek Protein G Mag Sepharose Xtra beads (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA) a specifických protilátek v poměru 10 µg:1 µg po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Buněčné lyzáty byly míchány s komplexy značka/protilátky po dobu 12 hodin při 4 °C, a proteiny byly izolovány precipitací magnetickou přitažlivostí (magnetická separace) s trojnásobným promýváním PBST. Precipitované proteiny byly zředěny vzorkovacím pufrem, 10 minut povařeny a po denaturaci analyzovány western blottem.

2.5 Kvantitativní Real-Time PCR

Celková RNA byla extrahována z buněk za použití sady Minirep Purification Kit (Genemark, Taipei, Taiwan), a reverzně transkripční PCR bylo provedeno za použití sady High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) za dodržení výrobcem doporučených postupů. Co se týče reverzní transkripce, bylo jako prvotní cDNA templát pro následný proces amplifikace použito 2µg celkové RNA. Pro amplifikaci daných cDNA byly použity tyto primery: ERα
(5'-TGGAGATCTTCGACATGCTG-3'
5'-TCCAGAGACTTCAGGGTGCT-3') [21]
β-aktin (5'-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3'
5'-GCCGATCCACACGGAGTACT-3').
cDNA a primery byly míchány přístrojem FastStart Universal SYB Green Master (Roche Applied Science) a měřeny v reálném čase na PCR přístroji (Applied Biosystems). Data představovaná Ct hodnotami byla analizována a upravena ve vztahu k hladinám housekeeping genu pro β-aktin.

2.6 Transfekce a Reportérové testy (Reporter Assays, popř. Gene Reporter Assays)

Buňky byly kultivovány po dobu nejméně 24 hodin a před transfekcí dosáhly 80% konfluence. Expresní plasmid byl předem smíchán s Lipofectamine 2000 Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) v souladu s pokyny výrobce. Komplex liposom/plasmid byl transfekován do buněk MCF-7 inkubovaných s Opti-MEM (Gibco) po dobu 6 hodin, a poté bylo přidáno kultivační médium pro expresi exogenních proteinů. Expresní plasmid pCMV5-ERα laskavě poskytnul profesor Chih-Yang Huang, Graduate Institute of Basic Medical Science, China Medical University, Taichung, Taiwan). Reportérové testy byly provedeny za účelem zjištění transkripční aktivity ERα poté, co byly buňky transfekovány genem pro luciferasový reportér obsahujícím 3xERE promotor (pGL2-TK-3 X ERE, jež darem poskytl Dr. Chih-Yang Huang, China Medical University, Taichung, Taiwan), a vnitřním kontrolním expresním plazmidem pSV-β-galaktosidasy (jež darem poskytl Dr. Jeremy J. W. Chen, National Chuang Hsing University, Taichung, Taiwan). Produkce reportérového genu luciferasy byla uskutečněna za použití systému Dual-Light (Applied Biosystems) a k měřením byl použit nástroj 1420 Multilabel Counter VICTOR3 (PerkinElmer Life Sciences). Surová data byla normalizována vzhledem k aktivitě β-galaktosidasy, aby se odfiltroval vliv různé efektivity jednotlivých transfekcí [19].

2.7 Statistika

Všechny hodnoty jako průměry +- standardní odchylka od průměru (SEM). Ve všech případech byl ke zhodnocení výsledků buněčné proliferace a reportérových testů použit Studentův t-test. Rozdíl mezi dvěma průměry byl považován za statisticky významný, pokud byla hodnota P < 0,05.


3. Výsledky

3.1 ERα hraje důležitou roli při inhibici růstu vyvolané emodinem a aloe-emodinem

Účinky různých koncentrací (0; 6; 12,5; 25; 50; 100 µM) emodinu a aloe-emodinu na růst ERα pozitivní buněčné linie rakoviny prsu MCF-7 byly zjišťovány počítáním buněk (0-6 dní) a MMT testy (4 dny). Léčba emodinem a aloe-emodinem vedla k potlačení růstu MCF-7, síla tohoto účinku závisela na použité dávce (Diagramy1(a) a 1(b)). Stojí za zmínku, že zejména od koncentrací 12,5 µM a více, měl aloeemodin na růst MCF-7 silnější účinek, než stejné dávky emodinu. MMT testy ukázaly významnou inhibici proliferace MCF-7, v závislosti na použité dávce, po léčbě emodinem o koncentracích 25-100 µM (Diagram 1(c)) a při léčbě aloe-emodinem při koncentracích o koncentracích 6-100 µM (Diagram 1(d)). Zatímco emodin byl účinnější proti ERα-negativní buněčné linii rakoviny prsu MDA-MB-453 než proti MCF-7 (Diagram 1(e)), inhibující účinek aloeemodinu na růst MDA-MB-453 byl mírný v porovnání s jeho účinkem na buňky MCF-7 (Diagram 1(f)). Dávka 25 µM aloe-emodinu nebyla schopna ovlivnit proliferaci buněk MDA-MB-453 (Diagram 1(f)), zatímco 25 µM emodinu tuto buněčnou proliferaci významně snížilo (Diagram 1(e)), což znamená, že by účinky aloeemodinu mohly být spojeny s ERα a tedy že se liší od účinků emodinu. Abychom hlouběji prozkoumali, zda se ERα podílí na inhibičních účincích léčby emodinem a aloeemodinem, prozkoumali a porovnali jsme účinky těchto látek na MCF-7 s přítomností a bez přítomnosti nadměrné exprese ERα. V návaznosti na léčbu aplikací 25 µM emodinu (Diagram 1(g)) nebo aloe-emodinu (Diagram 1(h)), byly buňky nadměrně exprimující ERα citlivější na léčbu pomocí léčiv, v porovnání s kontrolními buňkami. Podobné výsledky byly rovněž zaznamenány u další ERα-pozitivní buněčné linie, T47D (data nejsou přiložena). Tato data značí, že protein ERα hraje důležitou roli při potlačení proliferace buněk rakoviny prsu působením emodinu a aloe-emodinu, přestože se účinnost těchto dvou složek mírně liší.

3.2 Emodin a aloe-emodin snižují hladiny ERα proteinu a to v závislosti na čase a dávce

Aktivace ERα je vyvolána estrogenem a podněcuje zahájení a postup rakoviny prsu [22,23]. Detekovali jsme hladiny ERα po léčbě různými dávkami (0-100 µM, Diagramy 2(a) a 2(c)) emodinu nebo aloe-emodinu, a to po různě dlouhou dobu (0-48 h, Diagramy 2(b) a 2(d)). Kvantitativní výsledky přikládáme v dolních panelech přiložených diagramů. Data naznačují, že emodin a aloeemodin způsobily snížení hladiny proteinu ERα, a to v závislosti na čase a dávce.

3.3 Emodin a aloe-emodin snižují jaderný i cytosolický ERα a inhibují aktivaci ERα

Jelikož bylo zjištěno snížení hladin proteinu ERα v návaznosti na léčbu emodinem a aloe-emodinem, rozhodli jsme se vyšetřit stav aktivace ERα. Byla provedena frakcionace buněčných proteinů, která značila, že emodin a aloeemodin potlačily distribuci ERα proteinu jak v jádře, tak i v cytosolu (horní panely Diagramů 3(a) a 3(b)). Kvantitativní výsledky jsou presentovány v dolních panelech Diagramů 3(a) a 3(b). Navíc se ukázalo, že cytosolický ERα byl citlivější na léčbu, než jaderný. Na MCF-7 buňkách byl proveden reportérový test ERα. Data ukázala, že aloe-emodin významně inhiboval aktivitu promotoru cíleného ERα proteinem, a to v závislosti na dávce (Diagram 3(d)). V porovnání s aloe emodinem, emodin ve vysokých dávkách (25-100 µM) inhiboval ERα aktivaci mírně, zatímco nízké dávky emodinu (6 a 12,5 µM) měli tendenci aktivaci ERα zvyšovat. Navíc je těmito dvěma složkami možná ovlivněna exprese downstream (navazující) genů ERα. Diagramy 3(e) a 3(f) přinesly důkaz o tom, že při léčbě pomocí 25 µM emodinu nebo 25 µM po dobu 48 hodin, byla rovněž snížena exprese cyklinu D1, což je jeden z proteinů regulovaných ERα.

aloe emodin a rakovina prsu: diagram 1a
aloe emodin a rakovina prsu: diagram 1b
aloe emodin a rakovina prsu: diagram 1c

Diagram 1: Emodin a aloe-emodin inhibují růst buněk rakoviny prsu. Buňky MCF-7 byly léčeny různými koncentracemi emodinu (a) nebo aloeemodinu (b) a to po dobu 0 až 6 dní. Počty buněk byly spočítány pomocí barvení trypanovou modří. (c-f) buňkyMCF-7 a MDA-MB-453 byly léčeny různými koncentracemi emodinu a aloe-emodinu po dobu 4 dnů. Buněčná proliferace byla zjišťována MTT testy. Proliferace kontrolních buněk byla stanovena jako 1. Buňky MCF-7 byly přechodně transfekovány prázdným vektorem, nebo pCMV5-ERα a léčeny 25 µM emodinem (g) nebo aloeemodinem (h) po dobu 4 dnů. Účinnosti transfekovace nadměrné exprese ERα a počty buněk byly zjišťovány western blottem, respektive barvením tryptanovou modří. Výsledky byly prezentovny jako průměry +- SEM. * a ** koresponduje s P<0,05, respektive P<0,01, vztaženo ke kontrolní skupině nebo skupině s prázdným vektorem.

3.4 Léčba emodinem a aloe-emodinem vede k snížení proteinu ERα mechanismem proteazomální degradace

Jelikož byly v předchozích experimentech hladiny ERα proteinu ovlivněny jak emodinem, tak aloeemodinem, přikročili jsme ke zkoumání genové exprese a stability proteinu ERα. Nejprve jsme, v návaznosti na léčbu, detekovali expresi messenger RNA ERα pomocí real-time PCR. Zjistili jsme, že léčba 25 µM emodinu a 25 µM aloe-emodinu po dobu 24 h, neměla významný efekt ve srovnání s kontrolní skupinou (Diagram 4(a)). Protože hlavním procesem zapojeným do proteolýzy ERα je degradace závislá na ubikvitinu a proteazomu, byl jako druhý krok použit inhibitor proteazomů MG132, aby zabránil degradaci ERα proteinu, a poté byl pozorován účinek látek. Výsledky tohoto experimentu naznačily, že MG132 mohl zachránit ERα před degradací po léčbě emodinem nebo aloe-emodinem (Diagramy 4(b) a 4(c)). Tyto poznatky napovídají, že snížené hladiny ERα proteinu pozorované po léčbě emodinem nebo aloeemodinem, byly důsledkem proteazomální degradace.

3.5 Aloe-emodin podporuje disociaci ER a heat shock proteinu 90 a způsobuje ubikvitinaci ERα

Po odštěpení od heat shock proteinu 90 (HSP90) je protein ERα zpracován ubikvitinací. V přítomnosti MG132, který zabránil degradaci proteinu, jsme za pomoci imunoprecipitace zjistili, že aloe-emodin očividně zablokoval interakci mezi proteiny ERα a HSP90 (Diagram 5(a)); zato účinek vyvolaný emodinem nebyl tak významný (Diagram 5(b)). Kvantitativní grafy se nachází v dolních panelech přiložených diagramů. Dále jsme detekovali hladiny ubikvitinovaného ERα v extraktech z buněk léčených danými látkami za přítomnosti MG132, čímž jsme zkoumali ubikvitinaci ERα v závislosti na léčbě. Data indikovala, že léčba aloeemodinem zvýšila hladiny ERα konjugovaného s ubikvitinem. Degradaci proteinů bylo zabráněno přítomností MG132 bez ohledu na to, zda byl prvně imunoprecipitován ERα, nebo ubikvitin (Diagramy 5(c)). Přestože emodin mírně podpořil disociaci komplexu ERα/HSP90 (Diagram 5(b)), nebyl po léčbě emodinem pozorován žádný nárůst ubikvitinace ERα (Diagram 5(d)). Související kvantitativní výsledky se nachází v dolních panelech. Tyto značí, že pro emodinem vyvolanou proteazomální degradaci ERα nebyla nutná ubikvitinace. Tyto výsledky indikují, že aloe-emodin specificky snižuje hladiny proteinu ERα tím, že podporuje ubikvitinaci ERα, což vede k degradaci závislé na proteazomu.

3.6 Srovnání emodinu/aloe-emodinu a estrogenu z hlediska účinků na ERα

Ligandová vazba estrogenu, nebo estrogenu podobné molekuly, podporuje transaktivaci ERα, během které se ERα nejprve v cytoplazmě odštěpí od HSP90, a poté je translokován do jádra. Jelikož se účinky aloe-emodinu a emodinu na proces ubikvitinace ERα vzájemně liší, je důležité porozumět účinku těchto dvou sloučenin v porovnání s účinky estrogenu na chování ERα. Výsledky imunoprecipitačního experimentu značí, že aloeemodin měl na disociaci komplexu ERα/HSP90 podobné účinky (Diagram 6(a)) jako syntetický estrogen (estradiol benzoát (EB)), zatímco emodin podobný účinek neměl (Diagram 5(b)). Nicméně ve srovnání s léčbou EB, léčba aloe-emodinem vedla k poklesu jadérných a cytoplasmatických hladin proteinu ERα. Navíc pokled hladin proteinu ERα v důsledku léčby aloe-emodinem byl blokován MG132, což značí, že aloeemodin podporuje degradaci ERα (Diagram 6(b)). Ze srovnání dat v Diagramu 3(b) usuzujeme, že aloe-emodin přednostně indukuje ERα degradaci v cytoplazmě buněk rakoviny prsu. Zajímavé je, že se v důsledku léčby emodinem zvýšil jaderný ERα, a degradaci proteinů bylo zabráněno působením MG132 (Diagram 6(c)), což značí, že přestože emodin vyvolává degradaci ERα v jádře i cytoplazmě (srovnání s Diagramem 3(a)), že zároveň podporuje translokaci ERα do jádra, čímž se jeho působení liší od účinků aloe-emodinu. To by mohlo vysvětlovat, proč nízké koncentrace emodinu při ERα reportérovém testu vykazovaly mírně stimulující účinek (Diagram 3(c)). V souhrnu naše výsledky dokazují, že aloeemodin vyvolává disociaci ERα/HSP90 a následně podporuje degradaci ERα závislou na ubikvitinaci a proteazomu v cytoplazmě, čímž inhibuje translokaci ERα do jádra, kde by byl ERα jinak aktivován jako pozitivní modulátor.

aloe emodin a rakovina prsu: diagram 2

Diagram 2: Emodin a aloe-emodin snižují hladiny ERα proteinu. Buňky MCF-7 byly léčeny emodinem, nebo aloe-emodinem v závislosti na kdávce po dobu 24 h (a, c) a pomocí časového průběhu za použití 25 µM látky (b, d). Hladiny proteinu ERα byly detekovány western blottem. Β-aktin byl použit jako vnitřní kontrola. Kvantifikace hladin ERα je ve formě násobného zvýšení či snížení, v porovnání s kontrolní hladinou, a byla vyhodnocována ve třech nezávislých experimentech. Výsledky byly prezentovány jako průměr +- SEM. * a ** koresponduje s P<0,05, respektive P<0,01, oproti kontrolní skupině.


4. Diskuze

Rakovina prsu je běžnou malignitou mezi ženami, a estrogen hraje při ranném vývoji rakoviny důležitou roli. Estrogen, čímž se většinou myslí 17β-estradiol (E2), se váže na svůj primární receptor ERα a stimuluje transkripční aktivitu ERα, jež reguluje expresi downstream genů a buněčný růst [26,27]. Tamoxifen je navržen tak, aby interferoval s vazbou E2, čímž by blokoval transkripční aktivitu ERα a léčil tak ERα-dependentní nemoci jako je například rakovina prsu [28]. Nicméně existuje snaha nalézt alternativní sloučeniny, jež by byly bezpečnější a přinášely méně vedlejších efektů. Četné studie naznačují, že fytoestrogeny mají orgánově-specifické estrogenní a antiestrogenní účinky [29]. Fytoestrogeny sestávají hlavně z isoflavonů, jako je například genistein a daidzein, a jsou využívány k léčbě symptomů menopauzy a rovněž k léčbě rakoviny prsu [30,31]. V této studii přinášíme důkaz o tom, že dva fytoestrogeny - emodin a aloeemodin – mohou významně inhibovat proliferaci buněk ERα-pozitivní rakoviny prsu, díky degradaci ERα. Přestože obě látky inhibovaly proliferaci buněk rakoviny prsu a to v závislosti na dávce, nízké dávky (25 µM a méně) aloe-emodinu nemohly ovlivnit proliferaci ERα-negativních buněk (Diagram 1(f)). Proto byly v dalších experimentech požity dávky 25µM účinné látky (diagramy 3 až 6). Zajámavé bylo, že obě sloučeniny měly inhibiční účinnek na ERα, ale používaly při tom jiné inhibiční mechanismy. Aloeemodin inhiboval aktivaci ERα tím, že disocioval komplex HSP90/ERα a podporoval degradaci závislou na ubikvitinu, zatímco emodin touto molekulární cestou nešel. Tyto poznatky dokládají, že by sloučeniny emodin a aloe-emodin mohly sloužit jako modulátory estrogenového receptoru s různými molekulárními mechanismy. Terapeutické nasazení těchto dvou sloučenin by mělo být v budoucnu prozkoumáno.

aloe emodin a rakovina prsu: diagram 3

Diagram 3: Emodin a aloe-emodin snižují jak jaderné, tak cytoplazmatické hladiny ERα a jeho transkripční aktivitu. Buňky MCF-7 byly léčeny 25 µM emodinem (a) nebo aloe-emodinem (b) po dobu 24 hodin, poté byla provedena lýza buněk a frakcionace proteinů, jak je popsáno v sekci 2. Protein ER α byl detekován western blottem, a PARP a α-tubulin sloužily jako markery pro jaderné, respektive cytoplazmatické frakce. Kvantifikace hladin ERα byla prezentována jako násobné zvýšení, nebo snížení oproti kontrolním vzorkům a byla vyhodnocena ve třech nazávislých experimentech. Účinky emodinu (c) a aloeemodinu (d) na aktivaci ERα u buněk MCF-7, byly vyhodnocovány po dobu 48 hodin luciferásovým reportérovým testem s obsahem 3xERE (estrogen responsive element / element citlivý na estrogen). Exprese β-galaktosidasy sloužila jako vnitřní kontrola. Data byla prezentována jako násobná změna v porovnání s kontrolní úrovní (0 µM). Výsledky byly prezentovány jako průměr +- SEM. * a ** koresponduje s P<0,05, respektive P<0,01, oproti kontrolní skupině. Buňky MCF-7 byly léčeny emodinem (e) nebo aloe-emodinem (f) v závislosti na dávce po dobu 48h, a pomocí western blottu byla detekována exprese proteinu cyklin D1, který je regulován proteinem ERα.

aloe emodin a rakovina prsu: diagram 4

Diagram 4: Emodin a aloe-emodin snižují hladiny proteinu ERα tím, že podporují degradaci proteinu. (a) buňky MCF-7 byly léčeny 25 µM emodinu nebo aloe-emodinu po dobu 24 hodin, poté bylo provedeno real-time PCR, aby mohla být zhodnocena exprese mRNA ERα. Dara byla prezentována jako násobná změna v porovnání s kontrolní úrovní. Experimenty byly zopakovány třikrát s tím, že všechny podmínky v rámci každého ze tří experimentů, byly replikovány čtyřikrát. Výsledky jsou prezentovány jako průměr +- SEM. (b, c) buňky MCF-7 byly léčeny různými koncentracemi emodinu nebo aloeemodinu za přítomnosti MG132 (inhibitor proteazomů, 5 µM) po dobu 24 hodin. Hladiny proteinu ERα byly detekovány western blottem. Β-aktin sloužil jako vnitřní kontrola.

Antrachinony jsou fytoestrogeny, u kterých byly prokázány anti-rakovinné vlastnosti v důsledku toho, že tyto látky inhibují buněčnou proliferaci, indukují apoptózu a předchází metastázám [1]. Účinky emodinu a aloe-emodinu, jež jsou deriváty antrachinonu, byly intenzivně zkoumány na několika typech rakoviny, přičemž se studie zaměřovaly na cíle těchto látek v signálních drahách. O emodinu se ukázalo, že zvyšuje citlivost rakoviny plic s nadměrnou expresí Her2/neu vůči léčbě chemoterapeutiky, a dále že je schopen potlačit růst rakoviny prsu s nadměrnou expresí Her2/neu tím, že blokuje aktivitu tyrozinkinasy [32-34]. Za zmínku stojí, že u emodinu byla prokázána schopnost snižovat odpověď (down regulace) androgenového receptoru (AR) a inhibovat růst rakoviny prostaty [5], což naznačuje, že u rakovin spojenými s hormony existuje spojitost mezi deriváty antrachinonu a steroidními receptory. Přestože estrogenní schopnosti emodinu jsou vyšší než u aloe-emodinu, jak bylo zjištěno při studiích vazby s ERα, antiproliferační účinek aloeemodinu na rakovinu prsu je efektivnější, než účinek emodinu [7]. Kang a kolektiv také prokázali, že cytotoxicita aloe-emodinu na ERα-pozitivní buňky je vyšší než na ERα-negativní buňky. Z těchto poznatků vyplývá, že by aloe emodin mohl být silnějším inhibitorem růstu buněk ERα-pozitivní rakoviny prsu, než emodin.

Cílem této studie bylo prozkoumat odlišnosti mezi emodinem a aloeemodinem z hlediska jejich účinnosti a mechanismu, jakým blokují růst rakoviny prsu. Naše data ukázala, že aloe-emodin je mocnější inhibitor růstu než emodin, a že inhibice růstu buněk rakoviny prsu dociluje unikátním mechanismem. Růst buněk MCF-7 se po 6tidenní léčbě 12,5 µM aloe-emodinem zastavil, a při 4denní léčbě 25µM aloeemodinem přežilo jen 50 % buněk (Diagram1(b)). Přestože předchozí studie ukázala, že IC50 (koncentrace inhibující 50 % buněk) aloe-emodinu na buňky MCF-7 je 12,6 +- 0,83 µg/mL (přibližně 46 µM) [7], IC50 zjištěná v našem experimentu byla zhruba 25 µM (Diagram 1(d)). S ohledem na vedlejší účinky na normální buňky, předchozí reportáž naznačovala, že 25 µM aloe-emodin působí, z hlediska inhibice proliferace, silněji na buňky lidského epidermálního karcinomu, než na nerakovinné buňky [50]. Nicméně aloe-emodin významně nepůsobil na proliferaci MDA-MB-453 ERα-negativních buněk (Diagram 1(f)). Nadměrná exprese ERα u buněk MCF-7, zvyšovala citlivost na léčbu aloe-emodinem (Diagram 1(h)). Tyto výsledky jsou v souladu s předchozími zjištěními, že aloe-emodin má vyšší cytotoxický potenciál proti buňkám MCF-7 (ERα-pozitivní), než proti buňkám MDA-MB-231 (ERα-negativní) [7]. Při nízkém dávkování (10 µM) aloe-emodinu bylo pozorováno významné potlačení buněčného růstu (Diagramy 1(b) a 1(d)) a aktivace ERα (Diagram 3(d)), a to v závislosti na dávce, i při nízkých dávkováních (6 µM). Léčba aloe-emodinem navíc snížila nejen hladiny ERα proteinu v celkovém lyzátu (Diagramy 2(c) a 2(d)), ale rovněž v cytoplazmických a jaderných frakcích (Diagram 3(b)). Dopad léčby aloe-emodinem na cytoplazmatické hladiny ERα se zdál být vyšší než na jaderné hladiny ERα (Diagram 3(b)). Jak vyplývá z Diagramů 2 a 4, usuzujeme, že pokles v hladinách ERα vyvolaný aloeemodinem, byl v důsledku degradace proteinu. To koreluje s degradací ERα závislou na proteazomu, vzhledem k pozorovanému zvýšení hladin konjugátu ubikvitin/ERα (Diagram 5(c)). Pozoruhodné je, že byla v důsledku léčby aloe-emodinem zvýšena disociace ERα a HSP90 (Diagram 5(a)), a ERα, uvolněný z vazby sHSP90, podstoupil ubikvitinaci a následnou degradaci, místo toho aby byl translokován do jádra a tam aktivován (Diagram 6(b)). Tyto fenomény jsou podobné k účinkům antiestrogenů, jako je například ICI 164384, ICI 182780 a RU 58668, které mohou vyvolat degradaci ERα a vést k rychlému obratu [24]. Jsme toho názoru, že by aloe-emodin, jakožto ligand s inhibujícím účinkem na ERα, mohl zastávat roli modulátoru estrogenového receptoru, a sloužit k negativní regulaci aktivity ERα a inhibici růstu buněk rakoviny prsu.

aloe emodin a rakovina prsu: diagram 5

Diagram 5: Pouze aloe-emodin podporuje disociaci komplexu HSP90/ERα a následnou ubikvitinaci ERα. Interakce mezi ERα a HSP90, v buňkách MCF-7 po léčbě 25µM aloe-emodinu (a) nebo emodinu (b) v přítomnosti MG132 (5 µM) po dobu 24 hodin, byly vyhodnoceny imunoprecipitací ERα následovanou western blottem HSP90 se specifickými protilátkami. Hladiny ERα konjugovaného s ubikvitinem, v buňkách MCF-7 v návaznosti na léčbu 25 µM aloe-emodinu (c) a emodinu (d) za přítomnosti MG132 (5 µM), byly zjišťovány imunoprecipitací s protilátkami proti ERα nebo proti ubikvitinu, po které následoval western blott. Lyzáty byly použity pro experiment s western blottem, za účelem zjištění hladin proteinů. Imunoprecipitace s IgG sloužila jako negativní kontrola. β-aktin sloužil jako interní kontrola pro western blott. Kvantitativní data byla získána z výsledků třikrát provedené imunoprecipitace, a prezentována jako násobná změna oproti kontrole. Kvantitativní grafy byly prezentovány jako průměr +- SEM. * a ** koresponduje s P<0,05, respektive P<0,01, oproti kontrolní skupině.

aloe emodin a rakovina prsu: diagram 6

Diagram 6: Účinky aloe-emodinu a emodinu na subcelulární distribuci ERα v porovnání s EB. (a, b) buňky MCF-7 byly léčeny aloe-emodinem (25 µM) nebo estradiol benzoátem ((EB) 10 nM) za přítomnosti MG132 (5 µM) po dobu 24 hodin. Interakce mezi HSP90 a ERα byly vyhodnocovány imunoprecipitací ERα s následným western blottingem HSP90 se specifickými protilátkami. Imunoprecipitace pomocí IgG sloužila jako negativní kontrola. Byla provedena frakcionace buněčných proteinů a protein ERα byl detekován western blottem. (c) buňky MCF-7 byly léčeny emodinem (25 µM) nebo EB (10 nM) za přítomnosti MG132 (5 µM) po dobu 24 hodin. Byla provedena frakcionace buněčných proteinů a protein ERα byl detekován western blottem. PARP a α-tubulin sloužily jako markery pro nukleární, respektive cytoplazmatické frakce. Lyzáty byly použity pro western blotting, za účelem zjištění hladin proteinů. Β-aktin sloužil jako vnitřní kontrola pro western blott.

V této studii byl rovněž zkoumán účinek emodinu. Přestože inhibiční účinky emodinu na růst rakoviny prsu, a aktivaci ERα, byly podobné jako u aloeemodinu, molekulární mechanismus inhibice emodinem byl neočekávaně odlišný. V Diagramech 1(a) a 1(c) byl inhibiční potenciál emodinu na růst buněk MCF-7 nižší než účinek aloe-emodinu (Diagramy 1(b) a 1(d)). Zajímavé bylo, že emodin významně potlačil proliferaci buněk ERα-negativní buněčné linie MDA-MB-453 (Diagram 1(e)). Emodin může působit jako inhibitor tyrozinkinasy tím, že inhibuje vazbu Her2/neu s HSP90, čímž díky proteazomální degradaci vyčerpá Her2/neu [36]. Tímto by se dalo vysvětlit rozdílné působení emodinu na růst buněk MDA-MB-453 (které jsou charakteristické nadměrnou expresí Her2) nezávislé na ERα regulaci, v porovnání s aloe-emodinem. Stejně jako aloeemodin, i emodin vyvolával proteazomální degradaci ERα (Diagramy 2 a 4), nicméně tato degradační dráha byla nezávislá na disociaci HSP90/ERα a ubikvitinaci (Diagramy 5(b) a 5(d)). Přestože je degradace proteinů ubikvitin-proteazomovým systémem klíčovým procesem v modulaci mnoha proteinů, aktuální studie dokazují, že na proteazomu závislá degradace proteinů se může probíhat i drahami, které jsou nezávislé na ubikvitinaci [37,38]. Předchozí zprávy naznačovaly, že estrogenní aktivita emodinu je vyšší než tato aktivita aloe-emodinu [6,7]. Výsledky našeho ERE reportérového testu ukázaly, že emodin vyvolával inhibici ERα aktivace jen při vysokých dávkách (více než 25 µM, Diagram 3(c)), zatímco data o aloe emodinu ukazovala, že jeho inhibiční účinek začínal již při nízkých dávkách (6 µM, Diagram 3(d)). Za zmínku stojí, že při dávkách 6 a 12,5 µM vedla léčba emodinem k mírnému zvýšení aktivace ERα, což se liší od výsledků léčby aloe-emodinem (Diagram 3(c)). Na rozdíl od aloe-emodinu, léčba emodinem zvýšila hladiny jaderného ERα proteinu v přítomnosti MG132, čímž se účinky emodinu podobají účinkům estradiol benzoátu (EB; Diagram 6(c)). S příhlédnutím k datům v Diagramu 3(a) si myslíme, že emodin, mechanismem odlišným od aloe-emodinu, může způsobovat přesun ERα do jádra a následně vyvolat nukleární degradaci ERα prostřednictvím dráhy nezávislé na ubikvitinaci, zatímco cytoplazmatická ERα je ovlivněna méně. Tato hypotéza je podobná předchozím studiím, které naznačovaly, že chemická struktura ligandu přímo ovlivňuje jaderný osud a proteinový obrat ERα nezávisle na transkripční regulaci [39]. Tyto poznatky naznačují, že stěžejní rozdíl mezi emodinem a aloe-emodinem, spočívá v mechanismu regulace ERα a inhibice Her2.

V souhrnu tedy přinášíme důkazy o tom, že anti-rakovinné mechanismy působení antrachinonových derivátů, emodinu a aloe-emodinu, na buňky rakoviny prsu, jsou zprostředkovány ERα-dependentní cestou. Přestože emodin a aloeemodin jeví zřetelné rozdíly v efektivitě a mechanismu ovlivnění aktivace ERα a růstu buněk rakoviny prsu, jsou obě sloučeniny potenciálně využitelné k selektivní terapeutické léčbě rakoviny prsu.


Zkratky

ERα: estrogenový receptor α
HSP90: heat shock protein 90
AE: aloe-emodin
E: emodin


Střet zájmů

Autoři prohlašují, že u nich nedochází ke střetu zájmů.


Poděkování

The authors thank Dr. H. C. Chen, Dr. T. H. Lee, Dr. Y. M. Liou, Dr. J.W. Chen, and Dr. H. C. Cheng (National Chung Hsing University, Taiwan) for technical support. This work was supported by the following Grants: NSC100-2320-B-005-002 and NSC101-2320-B-005-004-MY3 fromthe Taiwan National Science Council (to H. Lin); Taichung Veterans General Hospital/National Chung Hsing University Joint Research Program (TCVGH-NCHU1017607 and TCVGHNCHU1027606); Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital Research Grant (CBBC001, to Y.-T. Lee); and the Taiwan Ministry of Education under the Aiming for the Top University plan.


Reference

autor název publikace
[1] Q. Huang, G. Lu, H.-M. Shen, M. C. M. Chung, and N. O. Choon Anti-cancer properties of anthraquinones from rhubarb Medicinal Research Reviews, vol. 27, no. 5, pp. 609–630, 2007
[2] A. Dutta, S. Bandyopadhyay, C. Mandal, and M. Chatterjee Aloe vera leaf exudate induces a caspase-independent cell death in Leishmania donovani promastigotes Journal of Medical Microbiology, vol. 56, no. 5, pp. 629–636, 2007
[3] H.-H. Wang and J.-G. Chung Emodin-induced inhibition of growth and DNA damage in the Helicobacter pylori Current Microbiology, vol. 35, no. 5, pp. 262–266, 1997
[4] C.-H. Chang, C.-C. Lin, J.-J. Yang, T. Namba, and M. Hattori Anti-inflammatory effects of emodin fromVentilago leiocarpa American Journal of ChineseMedicine, vol. 24,no. 2, pp. 139–142, 1996
[5] T.-L. Cha, L. Qiu, C.-T. Chen, Y. Wen, and M.-C. Hung Emodin down-regulates androgen receptor and inhibits prostate cancer cell growth Cancer Research, vol. 65, no. 6, pp. 2287–2295, 2005
[6] H. Matsuda, H. Shimoda, T. Morikawa, and M. Yoshikawa Phytoestrogens from the roots of Polygonum cuspidatum (Polygonaceae): structure-requirement of hydroxyanthraquinones for estrogenic activity Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, vol. 11, no. 14, pp. 1839–1842, 2001
[7] S. C. Kang, C. M. Lee, E. S. Choung et al. Anti-proliferative effects of estrogen receptor-modulating compounds isolated from Rheum palmatum Archives of Pharmacal Research, vol. 31, no. 6, pp. 722–726, 2008
[8] F.Acconcia and R.Kumar Signaling regulation of genomic and nongenomic functions of estrogen receptors Cancer Letters, vol. 238, no. 1, pp. 1–14, 2006
[9] S. Ali and R. C. Coombes Endocrine-responsive breast cancer and strategies for combating resistance Nature Reviews Cancer, vol. 2, no. 2, pp. 101–112, 2002
[10] C. K. Osborne Tamoxifen in the treatment of breast cancer The New England Journal ofMedicine, vol. 339, no. 22, pp. 1609– 1618, 1998. 12 Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine
[11] G. A. Colditz, S. E. Hankinson, D. J. Hunter et al. The use of estrogens and progestins and the risk of breast cancer in postmenopausal women TheNew England Journal ofMedicine, vol. 332, no. 24, pp. 1589–1593, 1995
[12] H. Adlercreutz and W. Mazur Phyto-oestrogens and Western diseases Annals of Medicine, vol. 29, no. 2, pp. 95–120, 1997
[13] M. C. Chen, C. Y. Huang, S. L. Hsu et al. Retinoic acid Induces apoptosis of prostate cancer DU145 cells through Cdk5 overactivation Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, vol. 2012,Article ID 580736, 11 pages, 2012
[14] H. Lin and P. S. Wang Inhibitory effects of digoxin on testosterone production in rat Leydig cells Adaptive Medicine, vol. 4, pp. 165–172, 2012
[15] H. Lin, T.-Y. Lin, and J.-L. Juang Abl deregulates Cdk5 kinase activity and subcellular localization in Drosophila neurodegeneration Cell Death and Differentiation, vol. 14, no. 3, pp. 607– 615, 2007
[16] H. Lin, M.-C. Chen, C.-Y. Chiu, Y.-M. Song, and S.-Y. Lin Cdk5 regulates STAT3 activation and cell proliferation in medullary thyroid carcinoma cells Journal of Biological Chemistry, vol. 282, no. 5, pp. 2776–2784, 2007
[17] H. Lin, M.-C. Chen, and C.-T. Ku Cyclin-dependent kinase 5 regulates steroidogenic acute regulatory protein and androgen production in mouse Leydig cells Endocrinology, vol. 150, no. 1, pp. 396–403, 2009
[18] H. Lin, J.-L. Juang, and P. S. Wang Involvement of Cdk5/p25 in digoxin-triggered prostate-cancer cell apoptosis Journal of Biological Chemistry, vol. 279, no. 28, pp. 29302–29307, 2004
[19] F.-N. Hsu, M.-C. Chen, M.-C. Chiang et al. Regulation of androgen receptor and prostate cancer growth by cyclindependent kinase 5 Journal of Biological Chemistry, vol. 286, no. 38, pp. 33141–33149, 2011
[20] M.-C. Chen, S.-W. Wang, S.-F. Kan, S.-C. Tsai, Y.-C. Wu, and P. S. Wang Stimulatory effects of propylthiouracil on pregnenolone production through upregulation of steroidogenic acute regulatory protein expression in rat granulosa cells Toxicological Sciences, vol. 118, no. 2, Article ID kfq302, pp. 667– 674, 2010
[21] M. Dalvai and K. Bystricky Cell cycle and anti-estrogen effects synergize to regulate cell proliferation and er target gene expression PLoS One, vol. 5, no. 6, Article ID e11011, 2010
[22] N. Heldring, A. Pike, S. Andersson et al. Estrogen receptors: how do they signal and what are their targets Physiological Reviews, vol. 87, no. 3, pp. 905–931, 2007
[23] Y. Miyoshi, K. Murase, M. Saito, M. Imamura, and K. Oh Mechanisms of estrogen receptor-α upregulation in breast cancers Medical Molecular Morphology, vol. 43, no. 4, pp. 193– 196, 2010
[24] M. Fan, A. Park, and K. P. Nephew CHIP (carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein) promotes basal and geldanamycin-induced degradation of estrogen receptor-α Molecular Endocrinology, vol. 19, no. 12, pp. 2901–2914, 2005
[25] R. A.Walker Oestrogen receptor and its potential role in breast cancer development The Journal of Pathology, vol. 188, no. 3, pp. 229–230, 1999
[26] D. J. Mangelsdorf, C. Thummel, M. Beato et al. The nuclear receptor super-family: the second decade Cell, vol. 83, no. 6, pp. 835–839, 1995
[27] J. M. Hall, J. F. Couse, and K. S. Korach The multifaceted mechanisms of estradiol and estrogen receptor signaling Journal of Biological Chemistry, vol. 276, no. 40, pp. 36869– 36872, 2001
[28] V. C. Jordan Tamoxifen (ICI46,474) as a targeted therapy to treat and prevent breast cancer British Journal of Pharmacology, vol. 147, no. 1, pp. S269–S276, 2006
[29] A. L. Murkies, G. Wilcox, and S. R. Davis Phytoestrogens Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 83, no. 2, pp. 297–303, 1998
[30] E.Nikander,A.Kilkkinen, M.Mets¨a-Heikkil¨a et al. Arandomized placebo-controlled crossover trial with phytoestrogens in treatment of menopause in breast cancer patients Obstetrics and Gynecology, vol. 101, no. 6, pp. 1213–1220, 2003
[31] Y. Imai, S. Tsukahara, S. Asada, and Y. Sugimoto Phytoestrogens/flavonoids reverse breast cancer resistance protein/ABCG2-mediated multidrug resistance Cancer Research, vol. 64, no. 12, pp. 4346–4352, 2004
[32] H. Jayasuriya,N.M.Koonchanok, R. L.Geahlen, J. L.McLaughlin, and C.-J. Chang Emodin, a protein tyrosine kinase inhibitor from Polygonum cuspidatum Journal of Natural Products, vol. 55, no. 5, pp. 696–698, 1992
[33] L. Zhang, C.-J. Chang, S. S. Bacus, and M.-C. Hung Suppressed transformation and induced differentiation of HER-2/neu-overexpressing breast cancer cells by emodin Cancer Research, vol. 55, no. 17, pp. 3890–3896, 1995
[34] L. Zhang and M.-C. Hung Sensitization of HER-2/neuoverexpressing non-small cell lung cancer cells to chemotherapeutic drugs by tyrosine kinase inhibitor emodin Oncogene, vol. 12, no. 3, pp. 571–576, 1996
[35] T.-H. Chou and C.-H. Liang The molecular effects of Aloe- Emodin (AE)/liposome-AE on human nonmelanoma skin cancer cells and skin permeation Chemical Research in Toxicology, vol. 22, no. 12, pp. 2017–2028, 2009
[36] Y.-Y. Yan, L.-S. Zheng, X. Zhang et al. Blockade of Her2/neu binding to Hsp90 by emodin azide methyl anthraquinone derivative induces proteasomal degradation of Her2/neu Molecular Pharmaceutics, vol. 8, no. 5, pp. 1687–1697, 2011
[37] Y. Murakami, S. Matsufuji, T. Kameji et al. Ornithine decarboxylase is degraded by the 26S proteasome without ubiquitination Nature, vol. 360, no. 6404, pp. 597–599, 1992
[38] G. Asher and Y. Shaul p53 proteasomal degradation: polyubiquitination is not the whole story Cell Cycle, vol. 4, no. 8, pp. 1015–1018, 2005
[39] S. Kocanova, M. Mazaheri, S. Caze-Subra, and K. Bystricky Ligands specify estrogen receptor alpha nuclear localization and degradation BMC Cell Biology, vol. 11, article 98, 2010

Souvislosti